Le tecniche di sequenziamento del DNA, dalla prima messa a punto ai giorni nostri

In cosa consistono, come sono state sviluppate, le applicazioni a oggi e il potenziale per il futuro.

Le tecniche di sequenziamento del materiale genetico, DNA, permettono di individuare l’esatto ordine, o sequenza, dei componenti, chiamati nucleotidi. Conoscere la sequenza di un frammento di DNA, o dell’intero genoma di un organismo, ha rivoluzionato le scienze biologiche e spianato la strada alle moderne biotecnologie, con applicazioni che vanno dalle scienze forensi alla biologia evolutiva. L’ormai celeberrimo tampone, il test con cui si raccoglie il campione di muco nasale in cui eventualmente individuare il virus Sars-Cov-2, è seguito da un esame di sequenziamento. L’esame infatti si basa sull’identificazione di specifiche sequenze del genoma a RNA del virus che viene sequenziato partendo da DNA a esso complementare.

I pionieri della sequenza

Nel 2017 sono stati festeggiati i primi 40 anni delle tecniche di sequenziamento, di cui le prime due hanno visto la luce nel 1977. Si trattava dei metodi Maxam-Gilbert e Sanger, che avevano preso il nome dai ricercatori che li avevano messi a punto. Entrambe le tecniche rendevano il sequenziamento abbastanza maneggevole da permettergli di entrare nella routine di un laboratorio. Fino a quel momento, infatti, era stato possibile sequenziare solo brevissimi frammenti, e con moltissimo lavoro. Il biochimico e premio Nobel Robert W. Holley, per esempio, aveva determinato nel 1964 la sequenza dello RNA transfer per l’amminoacido alanina, lungo 77 nucleotidi. Essendo l’RNA sintetizzato in maniera complementare a partire dal DNA, da questa sequenza si poteva dedurre indirettamente quella del gene corrispondente. Ma per ricomporre il puzzle di quelle 77 lettere, grazie a enzimi che tagliavano l’acido nucleico in punti precisi, ci erano voluti 9 anni di lavoro.

I due metodi di sequenziamento del 1977 sono concettualmente simili tra loro. Entrambi prevedono di creare una popolazione di frammenti di diversa lunghezza del DNA da sequenziare. Questi frammenti sono poi separati in base al peso, con un procedimento chiamato elettroforesi, e la sequenza è ricostruita sapendo che ciascun segmento si interrompe dove si trova un nucleotide noto. Mentre il metodo Maxam-Gilbert funziona tagliando il DNA di partenza in punti precisi, nel metodo Sanger il filamento da sequenziare viene duplicato artificialmente molte volte. La replicazione però si interrompe quando nel filamento complementare viene incorporato un nucleotide modificato, chiamato dideossinucleotide; per questo si parla anche di metodo a terminazione di catena.

Il fatto che i due metodi siano arrivati a compimento contemporaneamente ci dice che in quegli anni molti erano al lavoro sul problema. Nel 1980 la scoperta delle tecniche di sequenziamento è stata considerata meritevole del Nobel per la chimica, assegnato a Frederick Sanger e Walter Gilbert quali padri fondatori dell’ambito di ricerca e applicazione. Per Sanger fu addirittura il secondo Nobel: il primo, sempre per la chimica, gli era stato assegnato nel 1958, per aver determinato la sequenza di aminoacidi che compongono l’insulina, una proteina prodotta dal pancreas.

Genomi a mille dollari

Per il chimico inglese, la soddisfazione sarebbe stata doppia. A differenza di Gilbert, Sanger vide infatti il suo metodo rivoluzionare il mondo, perché alla fine fu la terminazione di catena, più semplice da automatizzare, più veloce, e che non necessitava di reagenti pericolosi, a imporsi nei laboratori. Da lì in avanti l’automazione diventò la chiave per ridurre i tempi e, quindi, i costi.

Per decenni il metodo Sanger è stato migliorato e usato in progetti sempre più ambiziosi. Nel 1995 fu sequenziato il genoma del primo batterio (Haemophilus influenzae), e l’anno successivo fu il turno di quello del primo eucariote: il lievito di birra Saccharomyces cerevisiae. Seguirono i genomi di altri organismi molto studiati in laboratorio, come il verme nematode Caenorhabditis elegans, il moscerino Drosophila melanogaster, la pianta Arabidopsis thaliana, e il topo Mus musculus.

Infine arrivò il Progetto genoma umano, completato nel 2003. Ma in questo caso il grosso del lavoro era già affidato a tecniche di sequenziamento di nuova generazione: quelle basate sul metodo Sanger erano ormai superate.

Le tecniche di sequenziamento più recenti, ancora in evoluzione, sono molto diverse tra loro ed estremamente complesse, ma hanno tutte qualcosa in comune: funzionano in parallelo, eseguendo contemporaneamente milioni di reazioni, e per ognuna di queste usano spazi ridottissimi (i cosiddetti biochip). Anche grazie agli sviluppi della bioinformatica, che permette di ricostruire la sequenza di un intero genoma dai suoi frammenti sequenziati, oggi bastano molto meno di mille dollari per ottenere il genoma di un individuo. Vent’anni fa il costo si aggirava sui 100 milioni.

Dal genoma alla cura

Il sequenziamento ci permette di avere sotto agli occhi il DNA di qualsiasi essere vivente, ma la maggior parte della ricerca scientifica si è concentrata su un’unica specie: Homo sapiens. Il principale obiettivo è capire il legame tra la sequenza dei 3 miliardi di lettere del nostro genoma e le malattie. Certo il sequenziamento, da solo, non può dirci nulla: un conto è riconoscere le lettere, un altro è saper leggere le parole, ma senza questo primo passaggio fondamentale il genoma sarebbe rimasto per sempre una semplice “scatola nera”.

Grazie a questo tipo di dati sappiamo invece oggi diagnosticare e classificare più facilmente alcune malattie, per esempio distinguendo tumori in apparenza simili, in base alle loro diverse mutazioni. In più, man mano che comprendiamo il ruolo delle sequenze genetiche e delle loro varianti, il sequenziamento si è rivelato una chiave per sviluppare cure sempre più mirate e personalizzate.

Negli ultimi anni anche le terapie geniche o cellulari, basate sulla correzione del DNA all’interno delle cellule, hanno fatto enormi passi avanti: si possono per esempio modificare geneticamente i linfociti di un paziente in modo che aggrediscano alcuni tumori.

Oggi la tecnica CRISPR/cas9, che permette di modificare facilmente sequenze di DNA a costi ridotti, promette di espandere ulteriormente questi benefici, rendendo le cure (spesso molto costose) disponibili a più persone. Tanto che le due inventrici della tecnica, le scienziate Emmanuelle Charpentier e Jennifer A. Doudna, si sono aggiudicate lo scorso mese di ottobre il premio Nobel per la chimica.